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亚搏体育app官网入口:不可不知的细胞检测方法——MTT

时间:2022-03-12 15:42:36 作者:亚搏体育app官网入口 点击:

本文摘要:MTT原理  MTT全称作3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学取名为3-(4,5-mtt二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:mtt噻唑蓝。

MTT原理  MTT全称作3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学取名为3-(4,5-mtt二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:mtt噻唑蓝。是一种朱颜色的染料。  MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。

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其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原成为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而杀细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能沉淀细胞中的甲瓒,用酶联成免疫系统检测仪在490nm波长处测量其光吸收值,可间接体现活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶构成的量与细胞数成正比。

该方法已普遍用作一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物检验、细胞毒性试验以及肿瘤放射线敏感性测量等。它的特点是灵敏度低、经济。

  缺点:由于MTT经还原成所产生的甲瓒产物不水溶液水,须要被沉淀后才能检测。这不仅使工作量减少,也不会对实验结果的准确性产生影响,而且沉淀甲的有机溶剂对实验者也有伤害。  MTT溶液的提炼方法  一般来说,此法中的MTT浓度为5mg/ml。

因此,可以称取MTT0.5克,水溶液100ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚白的培养基中,用0.22m滤膜过滤器以除去溶液里的细菌,敲4℃避光留存才可。在提炼和留存的过程中,容器最差用铝箔纸撕开。

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实验的时候我一般重开超净台上的日光灯来避光,实在这样较为好。  必须留意的是,MTT法不能用来检测细胞相对数和比较活力,但无法测量细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了确保实验结果的线性,MTT吸食光度最差在0-0.7范围内。  MTT一般最差现用现配,过滤器后4oC避光留存两周内有效地,或提炼成5mg/ml留存在-20度长年留存,防止重复冻融,最差小剂量填装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸撕开避光以免分解成。

我一般都把MTT粉填装在EP管里,用的时候现配,必要往培育板中加,没有适当一下子配上那么多,特别是在当MTT变成灰绿色时就意味著无法再用了。  MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最差带上那种半透明的簿膜手套.配制的MTT必须无菌,MTT对菌很脆弱;往96孔板加时不避光也没关系,却是时间较短,或者你不安心的时候可以把操作者台上的照明灯开动.  提炼MTT时用PBS(ph=7.4)沉淀。

PBS配方:Nacl8g+Kcl0.2g+Na2HPO41.44g+KH2PO40.24g调pH7.4,定容1L。  普通MTT法实验步骤:  1:疫苗细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配制单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞疫苗到96孔板,每孔体积200ul.  2:培育细胞:同一般培育条件,培育3-5天(可根据试验目的和拒绝要求培育时间)。

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  3:呈色:培育3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS提炼,pH=7.4)20ul.之后孵育4h,  中止培育,小心吸弃孔内培育上清液,对于漂浮细胞必须离心后再行吸弃孔内培育上清液。每孔加150ulDMSO,波动10min,使结晶物充份融化。  4:比色:自由选择490nm波长,在酶联成免疫系统监测仪上测量各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

  药物MTT法实验步骤  贴壁细胞:  1:搜集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔重新加入100ul,铺板使待测细胞徵密度1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填满)。  2:5%CO2,37℃孵育,至细胞单层布满孔底(96孔平底板),重新加入浓度梯度的药物,应以,细胞贴壁后才可特药,或两小时,或半天时间,但我们经常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则无法反应真实情况  3:5%CO2,37℃孵育16-48小时,长条显微镜下仔细观察。  4:每孔重新加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),之后培育4h。

若药物与MTT需要反应,可再行离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再行重新加入含MTT的培养液。  5:中止培育,小心吸去孔内培养液。

  6:每孔重新加入150ul二甲基亚砜,置摇床上短距离波动10min,使结晶物充份沉淀。在酶联成免疫系统检测仪OD490nm一处测量各孔的吸光值。  7:同时设置徵零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、完全相同浓度的药物沉淀介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。


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